آلفافیتو پروتئین یک گلیکوپروتئین با وزن مولکولی 70 کیلو دالتون می باشد. این پروتئین در حالت نرمال در دوران تکامل جنینی توسط سلول های کبدی، کیسه زرده و به مقدار کمی هم توسط مجاری گاسترواینتستینال تولید می شود. غلظت این پروتئین حدود 12 هفته بعد از حاملگی به بالاترین سطح  خود که بیشتر از 10 میلی گرم بر میلی لیتر است، می رسد و غلظت آن رفته رفته کاهش می یابد و حدود 1 سال بعد از زایمان به کمتر از 25 نانوگرم بر میلی لیتر می رسد و سپس سطح آن به کمتر از 10 نانوگرم بر میلی لیتر کاهش می یابد. غلظت این پروتئین در سرم بیماران مبتلا به سرطان کبد و تومورهای مرتبط با سلول های کیسه زرده به طور قابل توجهی افزایش می یابد و به عنوان یک بیومارکر بسیار  خوب برای تشخیص سرطان کبد به شمار می رود. هرچند سطح این پروتئین در زنان باردار هم بالا می باشد ولی بالا بودن بیش از حد آن می تواند به عنوان یک فاکتور ریسک برای سندرم داون باشد.

در این روش ابتدا کالیبراتور آلفا فیتوپروتئین، نمونه های بیمار و نمونه های کنترل به چاهک هایی که با آنتی بادی استرپتو آویدن پوشیده شده است، اضافه می شود. سپس مونوکلونال آنتی بادی بیوتینه شده به همراه آنزیم کونژوگه (علیه اپی توپ های مختلف آلفافیتوپروتین) اضافه می شوند و واکنش صورت می گیرد. واکنش بین آنتی بادی های مختلف ضد آلفا فیتوپروتئین و فرم بومی آلفافیتوپروتئین (آنتی ژن AFP) باعث تشکیل کمپلکس ساندویچی می شود و در نهایت این کمپلکس به چاهک هایی که با استرپتو آویدن پوشیده شده است می چسبند. بعد از اتمام فرایند انکوباسیون با چندین بار عمل شستشو، آن دسته از کمپلکس های Ab-AFP نشان دار شده که به چاهک چسبیده نشده اند، جدا می شوند. در نهایت با اضافه کردن سوبسترای آنزیمی مناسب می توانیم به فعالیت آنزیم در اثر رنگ تولید شده دست یابیم.

با استفاده از چندین سرم مرجع با غلظت آلفا فیتوپروتئین معلوم می توان گراف فعالیت آنزیم و غلظت آلفا فیتوپروتئین را ترسیم نمود. از طریق مقایسه با منحنی دوز پاسخ، می توان به میزان فعالیت یک نمونه مجهول که در واقع همان غلظت نمونه است پی برد.