تیروکسین هورمون اصلی تیروئید است که تقریباً در خون به حالت متصل به پروتئین ­های ناقل گردش می ­کند. ناقل اصلی آن گلوبولین متصل به تیروکسین (TBG) است. با این وجود تنها بخش آزاد تیروکسین مسئول اعمال زیستی آن است. غلظت پروتئین­ های ناقل در بعضی شرایط بالینی مثل حاملگی تغییر می­ کند. در عملکرد نرمال تیروئید، زمانی که غلظت پروتئین­ های ناقل تغییر می­ کند، میزان تیروکسین تام تغییر پیدا کرده، در حالی که غلظت تیروکسین آزاد ثابت باقی می­ ماند. بنابراین سنجش غلظت تیروکسین آزاد نسبت به تیروکسین تام تناسب بهتری با علائم بالینی دارد.

در بارداری، مصرف قرص ­های ضد حاملگی و استروژن درمانی میزان تیروکسین تام افزایش می­ یابد، در نتیجه گاهی میزان تیروکسین تام بیشتر از محدوده نرمال است، در حالی که میزان تیروکسین آزاد در محدوده نرمال می­ باشد. عملکرد مختل شده تیروئید نهفته ممکن است در اثر تغییر غلظت TBG در هر دو حالت هیپر و هیپوتیروئیدی اتفاق افتد. میزان تیروکسین تام ممکن است در اثر تغییرات TBG افزایش یا کاهش یابد. غلظت تیروکسین آزاد در آشکار کردن وضعیت بالینی بیمار کمک کننده است.

در این روش ابتدا کالیبراتور، نمونه بیمار یا کنترل به چاهک پوشیده شده با استرپتواویدین اضافه می­ شود. کنژوگه آنزیم-T4 (روش آنالوگ) اضافه شده و خوب مخلوط می­ شوند. واکنش رقابتی بین کنژوگه آنزیم و تیروکسین آزاد برای اتصال به تعداد محدودی از آنتی ­بادی کوت شده روی میکروپلیت اتفاق می­ افتد. بعد از دوره انکوباسیون کامل، آنتی­ بادی­ های باند شده به کنژوگه تیروکسین -آنزیم به کمک آسپیراسیون از بقیه کنژوگه تیروکسین –آنزیم متصل نشده جدا می ­شوند. فعالیت آنزیم موجود در چاهک به وسیله واکنش با سوبسترای مناسب و تولید رنگ سنجیده می­ شود. با استفاده از چندین استاندارد با سطح تیروکسین آزاد معلوم، یک منحنی دوز-پاسخ از فعالیت و غلظت ترسیم می­ شود که به کمک این منحنی می­ توان سطح هورمون تیروکسین آزاد را در نمونه مجهول تعیین نمود.